产生丰富的孢菌香味物质

作为中国“四大名醋”之一的山西酸菌山西老陈醋，其采用传统自然固体发酵并结合独特熏、老陈良芽淋、醋优醋酸晒等工艺，孢菌形成老陈醋独特的菌乳酸、绵、互作香、山西酸菌甜风味与口感。老陈良芽老陈醋的醋优醋酸独特风味得益于微生物菌群的生长和代谢以及复杂的协同作用，产生丰富的孢菌香味物质，除霉菌、菌乳酵母菌、互作乳酸菌、山西酸菌醋酸菌外，老陈良芽芽孢菌也是醋优醋酸山西老陈醋发酵生产过程中的重要微生物种群，它在老陈醋风味和功能成分的形成中起到重要作用。

芽孢杆菌是一类数量众多的细菌，需氧或兼性厌氧，杆状，革兰氏阳性，能够在某些条件下形成内生孢子。国内外关于芽孢杆菌的研究已有多年历史，对于芽孢杆菌的形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘以及生物防治等方面的研究已相当透彻。2016年，王进龙从山西老陈醋中分离出的芽孢菌有：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamy-loliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheni-formis）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、萎缩芽孢杆菌（Bacillusatrophaeus）、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）。

芽孢菌在陈醋酿造中起着重要的作用。乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川穹嗪的前体物质，而芽孢菌产乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更强、更稳定。国内外相关产乙偶姻菌种的筛选、育种、发酵工作也大都集中于芽孢菌。2015年，高文睿等从凉州熏醋中筛选出高产乙偶姻的芽孢菌Y4，产量为2.376mg/mL；2013年，张显采用传统诱变方法对枯草芽孢杆菌JNA3-10进行复合诱变，获得1株2，3-丁二醇脱氢酶（BDH）缺失型乙偶姻高产突变株JNA-UD-6，消耗150g/L葡萄糖，得到53.9g/L的乙偶姻和6.5g/L的2，3-丁二醇；2017年，Li等通过改变2，3-丁二醇的转化策略，提高了地衣芽孢杆菌乙偶姻的产量。芽孢菌在陈醋中除对产乙偶姻有重要贡献外，还产生多酚类物质，从而赋予山西老陈醋抗氧化的功能。2014年，郇阿梅等从四川传统麸醋醋醅中筛选出1株芽孢菌YB-32，培养24h后产生的总酚含量为263.6μg/mL。另外，芽孢菌还可产不挥发性酸，缓解山西老陈醋中乙酸的强烈刺激性酸味，使醋的口感更柔和醇厚。芽孢菌的代谢产物与发酵体系中的其它物质发生反应，生成一些风味物质，如乳酸乙酯、乙酸乙酯、柠檬酸乙酯、二羟基丙酮等，这些物质可以很好地改善食醋风味。在白酒产业中，关于产香芽孢菌的筛选和应用积累了大量的研究资料，而在陈醋研究中鲜有关于产香芽孢菌的筛选和应用方面的报道。

醋酸菌和乳酸菌是山西老陈醋醋酸发酵阶段的优势细菌菌群。醋酸菌是陈醋醋酸发酵过程中的主要菌种，可以通过乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶催化反应将醇代谢为酸。目前，陈醋酿造中常用的醋酸菌有奥尔兰醋杆菌（Acetobacterorleanense）、许氏醋杆菌（Acetobacterschuegenbachii）、弯曲醋杆菌（Acetobactercurvum）、纹膜醋杆菌（Aceto-bacteraceti）、恶臭醋酸杆菌（Acetobacterran-cens）、攀膜醋杆菌（Acetobacterascendans）、胶膜醋杆菌（Acetobacterxylinum）等。醋酸菌在酿醋过程中除产酸外，还产乙偶姻（川穹嗪前体物质）等功能性物质。Dai等报道了1株汉氏醋杆菌（acetobacterhansenii）产乙偶姻量达8.93g/L。在醋酸发酵阶段中除醋酸菌产酸外，乳酸菌也可产生乳酸等不挥发性酸，减缓由总酸含量引起的刺激味道，使酸味更柔和、醇厚。此外，乳酸菌产生的乳酸及其它不挥发性酸与醇类物质生成乳酸乙酯等各种酯类物质，也可丰富山西老陈醋的风味和香气。

微生物之间的互相作用可以增加其代谢物和功能物质的含量。关于芽孢菌间的互作研究主要集中在白酒大曲的强化。2011年，杨涛等将5株嗜热芽孢杆菌、3株酵母菌及1组复合产酸菌应用于酱香白酒生产中，使得香味基酒的比例增加，并且白酒中的己酸和己酸乙酯含量也显著提高；2017年，庄孝杰等从酱香型酒醅中筛选出具有优良特性的拜耳接合酵母，研究其与地衣芽孢杆菌的互作，结果表明地衣芽孢杆菌促进了拜耳接合酵母的乙醇转化率，共培养体系中风味物质的种类和含量也受到很大影响。2015年，吉晋波对分离自镇江香醋醋醅的8株乳酸菌及2株醋酸菌的相互作用进行了研究，结果表明醋醅中醋酸菌与乳酸菌稳定共存，并对比分析了二者纯培养及共培养发酵液中风味化合物的差异。

本文从山西老陈醋酿造过程中分离的54株芽孢菌中，筛选出2株发酵性状优良的芽孢杆菌菌株，研究了这两株芽孢菌之间，及与醋酸菌和乳酸菌间的相互作用，考察了其在纯培养和不同比例共培养条件下对生物量、乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸、有机酸和挥发性香气成分的影响，为将来进一步开发山西老陈醋酿造复配直投式发酵剂进行了重要的基础研究和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

醋醅取自醋厂醋酸发酵0，1，3，5，7，9，11d的醋醅。巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19为实验室前期筛选的优势优良菌株，保存至山西农业大学食品与工程学院生物工程实验室。

1.1.2 培养基与试剂

MRS培养基，青岛高科园海博生物科技有限公司；模拟醋醅培养基，山西老陈醋醋厂醋酸发酵第2天的醋醅，即为模拟醋醅培养基；醋酸菌培养基：酵母10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌后加4%无水乙醇。细菌DNA提取试剂盒，北京博迈德基因科技有限公司；PCR引物，由深圳华大基因公司合成；MakerD、MIX，上海生工生物工程有限公司；福林试剂、肌酸（均为分析纯），北京索莱宝科技有限公司；草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯），天津市光复精细化工研究所。

1.2 主要仪器、设备

T100型PCR仪、UniversialHoodⅡ型凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一仪器厂；722型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；戴安U3000液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；Trace1300气相色谱仪，TraceISQ质谱分析仪；5417R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山西老陈醋源芽孢菌的分离和鉴定

在无菌、常温条件下，将25g样品加入内置玻璃珠的225mL无菌生理盐水中，140r/min振荡培养20min，使其混匀；然后梯度稀释，选取10^-5，10^-6，10^-73个梯度，涂布于MRS琼脂平板培养基中，37℃恒温培养箱中培养1～2d。选取菌落数在30～300的平板，挑取其上表面粗糙、菌落形态较大的单个菌落涂片和革兰氏染色，在电子显微镜（1000×）下观察菌株细胞形态和拍照。对镜检结果为革兰氏阳性、有芽孢的杆状菌株用试剂盒提取其基因组，16SrDNA测序比对，并用MEGA5.1软件构建系统进化树。应用的引物如下：上游：5′-CA-GATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′；下游：5′-CGACTTCACCCAATCATCTG-3′。将鉴定结果为芽孢菌的，反复划线于MRS平板培养基，37℃培养，直至获得纯化的菌株，对其菌落拍照。

1.3.2 山西老陈醋源优良芽孢菌的筛选

将54株已鉴定的芽孢菌接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h后，取菌株发酵液3mL，参照文献、测定总酯含量及不挥发性酸含量。将发酵液8000r/min离心10min，取上清液1mL，采用福林-酚比色法测定多酚含量。取上清液3mL，采用O'Meara-比色法测定乙偶姻含量。

1.3.3 解淀粉芽孢杆菌1539与枯草芽孢杆菌803的相互作用研究

将筛选出的优良芽孢菌株解淀粉芽孢杆菌1539与枯草芽孢杆菌803分别接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，菌体浓度均达到1×10⁶CFU/mL时，分别按照解淀粉芽孢杆菌1539与枯草芽孢杆菌803接种比例为1:0，0:1，1:0.1，1:0.5，1:1，1:5，1:10（V/V），总接种量为2%，加入30g醋醅模拟培养基，37℃静置培养6d。

1）生物量的测定

采用MRS培养基稀释平板菌落法测定解淀粉芽孢杆菌1539与枯草芽孢杆菌803的生物量。

2）乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量的测定

取10g上述培养6d的样品，加入90mL蒸馏水浸泡30min，4000r/min离心10min，取上清液，采用上述1.3.2节方法，测定纯培养和共培养体系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量。

3）有机酸含量的测定

取5g上述培养6d的样品，用超纯水定容50mL，12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，采用外标法测定草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸等8种有机酸的含量，用He-mI和Simca软件绘制有机酸的Heatmap图和PCA图。色谱测定条件为：液相系统UItimate3000；色谱柱C184.6mm×150mm，5μm；流动相20mmol/LNaH2PO4，pH2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。

4）挥发性香气种类和含量的测定

采用顶空固相微萃取方法萃取上述培养6d的1g样品，用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量，用HemI和Simca软件绘制挥发性香气的Heatmap图和PCA图。色谱条件：色谱柱为VF5MS（30mm×0.25×0.25mm），载气为氦气（纯度99.999%），流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃的速度升至160℃，保持1min，再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41～500amu。

相关链接：丙酮酸，苹果酸，乙偶姻，酒石酸

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